Entré à la Comédie-Française en 1750 ; sociétaire en 1751 ; doyen de 1773 à 1778.

Le Kain peut être considéré comme l'un des comédiens-phares du XVIIIe siècle, ayant joué un rôle décisif dans l'évolution de l'art théâtral.

Il débute en amateur sur des théâtres de société dont les Comédiens français, jaloux de leur monopole, finissent par faire interdire les représentations. Voltaire, l'ayant apprécié, lui conseille d'abandonner le commerce familial d'orfèvrerie et de fabrication d’instruments chirurgicaux, pour se consacrer entièrement au théâtre. Il lui prodigue ses leçons et l'installe rue Traversière. Des représentations privées de Rome sauvée et de Mahomet remportent un tel succès qu'un ordre de début appelle Le Kain à la Comédie. Il débute en 1750 dans le rôle de Titus de Brutus (Voltaire).
Son physique, plutôt ingrat et lourd, sa voix peu agréable choquent au premier abord, mais l'intelligence de son jeu et la sensibilité de ses expressions le transfigurent en scène au point de bouleverser le public.
À force de travail et de persévérance, il impose son style et sa personnalité. Il est reçu sociétaire en 1751, soutenu par Voltaire dont il créera de très nombreuses œuvres sur la scène de la Comédie-Française : Rome sauvée, L’Orphelin de la Chine, L’Écossaise, Tancrède, Olympie, Le Triumvirat, Adélaïde Du Guesclin, Les Scythes. Ses meilleurs rôles et ses plus grands succès sont ceux de Zamore (Alzire), Séide (Mahomet) et Orosmane (Zaïre), qu'il n'a pas créés mais qu'il marque de son empreinte. Il joue aussi Piron (Gustave Wasa), Crébillon (Rhadamiste et Zénobie), Du Belloy (Gabrielle du Vergy) et autres Lemierre et La Harpe. Il n'est pas fait pour la comédie, où il crée néanmoins Le Philosophe sans le savoir de Sedaine. Dans la tragédie classique, il interprète avec intelligence Néron de Britannicus, Oreste d'Andromaque, Rodrigue du Cid, etc., mais ses fureurs pathétiques conviennent plus à ce qu'il est admis d'appeler le « drame » de Voltaire et consorts.

C'est essentiellement un novateur. Avec l'aide de Mademoiselle Clairon, il s'attache à réformer le costume tragique, dans le sens d'une plus grande rigueur, qu'il s'agisse d'évoquer la simplicité antique ou l'exotisme oriental, et refuse panaches, tonnelets et paniers jusqu'alors indispensables au jeu tragique. On lui doit aussi la suppression des banquettes installées sur scène, où se pavanaient des spectateurs favorisés et constituant une entrave au jeu et à la décoration. En 1759, la scène, une fois libérée de ces spectateurs encombrants – grâce à l'influence conjuguée de Le Kain et Voltaire et à l'argent du comte de Lauraguais, – peut être équipée de décors nouveaux et somptueux dans lesquels les acteurs évoluent selon une véritable « mise en scène ». Les archives de la Comédie-Française conservent quelques registres de la main de Le Kain, qui constituent des embryons de livres de régie, indiquant les entrées, les sorties et les places des comédiens, les mouvements de la figuration et les éléments essentiels des costumes.

L'action de Le Kain, qui innove également en matière de tournées en province et à l'étranger, ne se borne pas aux choses de la scène. Il s'est aussi penché sur l'administration du théâtre, mettant la main aux règlements en vigueur dans les années 1760 et réformant les attributions du Comité d'administration. Il rédige de nombreux mémoires sur ces sujets, projette la création d'une école dramatique, qu'il n'aura pas lui-même l'occasion de voir naître, et forme des élèves dont Madame Vestris.

Il meurt brusquement en 1778, épuisé par une vie trop active, deux jours avant l'arrivée à Paris de son ami Voltaire qui, curieuse coïncidence, ne le vit jamais jouer ses œuvres sur la scène de la Comédie-Française, mais en revanche joua en sa compagnie aux Délices et à Ferney où il l'invitait régulièrement. C'est aussi Voltaire qui fut à l'origine des représentations données à Bayreuth et à Potsdam.
Référence pour ses successeurs, notamment pour Talma, Le Kain a laissé des Mémoires, publiées par un de ses fils en 1801.