Claude Mathieu se forme au Conservatoire de Rouen avant de rejoindre, en 1972, la compagnie d’Alain Bézu qui donna naissance au Théâtre des Deux-Rives. En 1976, elle entre au Conservatoire national supérieur d’art dramatique de Paris où elle est l’élève d’Antoine Vitez et de Marcel Bluwal. Ce dernier la dirige dans Dom Juan revient de guerre d’Ödön von Horváth au Théâtre de l’Est Parisien. Jacques Rosner la met en scène d’abord dans La Double Inconstance de Marivaux au Théâtre des Bouffes du Nord, puis dans Du côté des îles de Pierre Laville au Théâtre de l’Odéon. Pierre Romans la dirige dans Fugue en mineur(e) de Pierre Léaud au Petit Odéon, puis dans L’Illusion comique de Corneille au Théâtre de la Commune. Engagée comme élève-stagiaire à la Comédie-Française en 1979, elle y débute en interprétant Irina dans Les Trois Soeurs de Tchekhov mises en scène par Jean-Paul Roussillon.

474e sociétaire à partir du 1er janvier 1985, elle est la Doyenne de la Troupe du 1er janvier 2017 au 31 décembre 2023. Elle y interprète quantité d’oeuvres du répertoire, de Molière à Racine, en passant par Hugo, Goldoni, Corneille, Beaumarchais, Brecht, Horváth ou encore Offenbach, etc. dirigée par de grands noms de la mise en scène : Jean-Luc Boutté, Jorge Lavelli, Antoine Vitez, Alain Françon, Jacques Lassalle, Daniel Mesguich,Denis Podalydès, Galin Stoev, Emmanuel Daumas...
Plus récemment, elle est mise en scène par Éric Ruf (Peer Gynt d’Ibsen et Roméo et Juliette de Shakespeare), Lilo Baur (La Maison de Bernarda Alba de Federico García Lorca), Louise Vignaud (Phèdre de Sénèque), Ivo van Hove (Électre/Oreste d’Euripide, Le Tartuffe ou l’Hypocrite de Molière), Christine Montalbetti (La Conférence des objets, un texte écrit pour la Troupe), Christophe Honoré (Le Côté Guermantes d’après Marcel Proust) qui la dirige aussi dans le film Guermantes qu’il tire de l’arrêt de la pièce pendant le confinement de 2020, Maëlle Poésy (7 minutes de Stefano Massini) et Arnaud Desplechin (Père de Strindberg). Ce dernier la fait tourner dans La Forêt, téléfilm diffusé sur Arte en 2014, puis dans Trois souvenirs de ma jeunesse, sorti au cinéma en 2015.

Claude Mathieu signe la dramaturgie de Sur la grand-route de Tchekhov pour la mise en scène de Guillaume Gallienne, qu’elle dirige au Studio-Théâtre dans le seul-en-scène Saint François, le divin jongleur (repris en 2020 au Studio Marigny sous le titre François, le saint jongleur), puis au Théâtre de l’Ouest parisien dans la pièce autobiographique Les Garçons et Guillaume, à table !, adaptée plus tard au cinéma. Elle est également conseillère artistique sur Maryline, deuxième long métrage de Guillaume Gallienne sorti en 2017 où elle joue aussi le rôle d’Hélène.

En 2009, elle met en scène Le Monde selon Bulle d’Agathe de La Boulaye, au Petit Hébertot. Très impliquée dans l’univers musical, Claude Mathieu prend part aux spectacles musicaux de la Comédie-Française et dirige notamment le Cabaret Léo Ferré. En concert, comme récitante, elle tient le rôle-titre dans Perséphone de Stravinsky au Royal Albert Hall et au London Royal Festival Hall.

En 2017, elle participe à la lecture de Bérénice et en 2019 à celle d’Esther de Racine dans le cadre de l’enregistrement de l’intégrale des tragédies de l’auteur avec France Culture.
Elle participe à la création de la Web TV La Comédie continue ! mise en place lors du premier confinement de mars 2020 et joue régulièrement depuis dans les Théâtres à la table, objets audiovisuels créés et diffusés dans le cadre de la programmation numérique de la Comédie-Française.

Elle devient sociétaire honoraire de la Comédie-Française le 1er janvier 2024.

Claude Mathieu est chevalière dans l’ordre des Arts et des Lettres, chevalière dans l’ordre du Mérite et chevalière de la Légion d’honneur.