Après une formation en art dramatique, trombone et guitare au Conservatoire à rayonnement régional de Lille, où il obtient un premier prix de trombone, Stéphane Varupenne entre au Conservatoire national supérieur de musique et de danse de Paris et poursuit son cursus au Conservatoire national supérieur d’art dramatique. Il choisit dès lors de se consacrer au théâtre tout en continuant à intégrer la musique dans sa pratique artistique.
Il rejoint la Comédie-Française comme pensionnaire en 2007 et est nommé 528ᵉ sociétaire en 2015.

Parmi les nombreux rôles qui mettent à l’honneur ses talents de musicien, il incarne Mike Bloomfield pour Sébastien Pouderoux et Marie Rémond dans Comme une pierre qui… d’après Like a Rolling Stone, Bob Dylan à la croisée des chemins. Il est récemment à l’affiche du Silence par Lorraine de Sagazan tandis que Thomas Ostermeier lui confie les rôles de Brown dans L’opéra de quat’sous, du Foudans Le Roi Lear et de Feste, le fou d’Olivia dans La Nuit des rois ou Tout ce que vous voulez. Il multiplie les rencontres théâtrales, jouant Marcel pour Christophe Honoré dans Le Côté de Guermantes d’après Proust, et dans Guermantes, la fiction cinématographique qui a suivi. Sganarelle dans le Dom Juan d’Emmanuel Daumas – après avoir été son Arlequin dans L’Heureux Stratagème de Marivaux –, il interprète Cléante dans Le Tartuffe ou l’Hypocrite monté par Ivo Van Hove et le rôle-titre dans Britannicus par Stéphane Braunschweig. Il est dirigé par Guy Cassiers dans son adaptation des Démons de Dostoïevski, Alain Françon dans Goldoni (La Locandiera), Edward Bond (La Mer) et Tchekhov (Les Trois Sœurs), auteur qu’il joue aussi pour Julie Deliquet (Vania).Parmi ses nombreuses autres collaborations, citons Katharina Thalbach (La Résistible Ascension d’Arturo Ui), Denis Podalydès (Lucrèce Borgia et Cyrano de Bergerac), Éric Ruf (Peer Gynt) ou Jérôme Deschamps (Unfil à la patte).

Avec Le Suicidé d’Erdman, il présente sa première mise en scène en solo après avoir signé en 2022, en binôme avec Sébastien Pouderoux, celles des Précieuses ridicules de Molière et du spectacle musical Les Serge (Gainsbourg point barre). Il codirige aussi avec lui le Théâtre à la table musical, Le Bœuf sur la table.

Au cinéma, il tourne notamment dans Petite Maman de Céline Sciamma et Le Comte de Monte-Cristo de Matthieu Delaporte et Alexandre de La Patellière.